PCR Digital y la Persistencia del VIH

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PCR Digital y la Persistencia del VIH

6. Aplicaciones y Perspectivas Futuras

PCR Digital Multiplexada que ayudaría a comprender la diferencia entre ensayos de crecimiento viral y PCR, y estudiar la expansión clonal

Gotas unicelulares para estudiar dinámicas de latencia

Avances deseados

Control de calidad de las particiones

Análisis de datos y configuración de umbrales

Sistemas multiplex de mayor capacidad

Medición del Reservorio en Estudios: Evaluación de terapias tempranas, vacunas terapéuticas, trasplantes, interrupciones de tratamiento, anticuerpos neutralizantes, agentes reactivadores de la latencia (LRA) y otros agentes

5. Desafíos de la PCR Digital

PCR Dúplex, casos de amplificación de un solo objetivo con causas no claras

sensibilidad de qPCR en ciertos casos

Falsos positivos, en las plataformas actuales incluyendo QX200

Determinación del Umbral: Crítica para la cuantificación fiable; la presencia de gotas con fluorescencia intermedia ("rain") complica la asignación

4.Ventajas de la PCR Digital sobre qPCR

Mayor Precisión y Reproducibilidad para medir efectos en el reservorio del VIH

Mayor Robustez y menos susceptible a inhibidores y a la reducción de la eficiencia de amplificación

Las pequeñas diferencias entre primers/sonda y el VIH heterogéneo no afectan la cuantificación si la fluorescencia final supera el umbral

No requiere curva estándar para cuantificar ADN

3. Plataformas de PCR Digital

QX200 ddPCR, la plataforma más utilizada en la investigación del VIH

Plataformas Automatizadas

Combinación

Basadas en Emulsión (gotas)

Basadas en Arrays

Métodos de Particionamiento (manual y automatizado)

Distribución de la muestra en múltiples particiones

2. Principios de la PCR Digital (dPCR)

La dPCR es ahora una herramienta de cuantificación ampliamente aceptada

Aplicación en VIH, se combinó PCR con dilución límite para cuantificar provirus

El concepto se aplicó inicialmente para detectar objetivos raros

Umbral para distinguir particiones positivas y negativas

Las particiones con la molécula diana emiten fluorescencia

Divide la muestra aleatoriamente en múltiples particiones

Tecnología valiosa e indispensable en la investigación del VIH

La PCR digital (dPCR) emerge como una estrategia para la cuantificación de ácidos nucleicos

1. Antecedentes y Problemas

La PCR en tiempo real (qPCR) ha sido la herramienta estándar para medir el reservorio viral (ADN y ARN del VIH)

Es crucial cuantificar para encontrar una cura

Rebote Viral si se interrumpe el TARGA

Persistencia del VIH como ADN proviral en células CD4+ T latentes a pesar del tratamiento antirretroviral (TARGA)